影響ELISA實(shí)驗的因素和對策

ELISA試驗以靈敏度較高、特異性較好的特點(diǎn)在科研上得到了廣泛的應(yīng)用，但操作中的各個環(huán)節(jié)對試驗的檢測效果影響較大，如不注意，有可能導(dǎo)致顯色不全、花板等結(jié)果。  

下面將操作中各個環(huán)節(jié)常出現(xiàn)問題的原因及解決辦法總結(jié)于下：  

選擇試劑：  
選擇質(zhì)量優(yōu)良的檢測試劑，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。  
參考準(zhǔn)備ELISA實(shí)驗的正確步驟#ELISA實(shí)驗的事前準(zhǔn)備工作一  
標(biāo)本收集與保存：  
避免使用肉眼可見的溶血標(biāo)本、高脂標(biāo)本和混濁標(biāo)本；  
2-8℃下，標(biāo)本可放置24-48小時，長期保存需放置-20℃下。  
請避免反復(fù)凍融。  
具體請參照：  
ELISA實(shí)驗標(biāo)本的采集與處理：  
ELISA實(shí)驗標(biāo)本的保存：  
試劑使用中的準(zhǔn)備工作及注意事項：  
試劑盒中會有提示，一般需要準(zhǔn)備的有：  
洗滌液；用前配制；有的試劑盒會標(biāo)明，配好的4度下一般可以放一個月；如果沒有標(biāo)明，盡量用新鮮的，不要多配制。  
顯色液（有A液和B液的），用前15分鐘配制；  
標(biāo)準(zhǔn)品：有的試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品是已經(jīng)配制好的，4度保存；有的是要現(xiàn)配制的；按照說明書操作；  
濃縮生物素結(jié)合的二抗和HRP：如果需要配制，試劑盒沒注明配好可以保存多久的話，盡量現(xiàn)配現(xiàn)用（用前15分鐘配制）；  
原則是：  
試劑盒上沒有指出配制物的儲藏方式的話，應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用；不要怕麻煩；  
還有，小瓶的管子開蓋前要離心，以免蓋子上粘連以後總量不夠。  
加 樣： 
室溫溫育的試劑，特別是溫育時間比較短的實(shí)驗操作的試劑，加樣對數(shù)據(jù)的影響比較大。特別要注意加樣問題。  
不好的操作原因：  
不會正確使用加樣器；  
血清或血漿標(biāo)本分離不好即進(jìn)行加樣；  
手工操作中，加樣板過多造成加樣後放入孵箱前等待時間過長（特別是室內(nèi)溫度較高時）；  
加完標(biāo)本再加酶試劑時酶濺出孔外； 
解決辦法：  
熟悉加樣器的使用，在進(jìn)行實(shí)驗之前用水來練習(xí)加樣的快速和準(zhǔn)確；  
試驗前標(biāo)本需緩慢升溫至室溫，若標(biāo)本為血清，凍結(jié)血清融解後，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清後再檢測；  
加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出；  
加樣後及時放入孵箱；  
加酶試劑後用吸水紙在酶標(biāo)板表面輕拭吸干；  
如果采用AT或其他全自動加樣，選擇FAME或其他後處理儀器加酶試劑；  
標(biāo)本較多時，請分批操作。每次加樣在兩到三分鐘內(nèi)完成。加標(biāo)本時三排一加。每次加完樣進(jìn)行計時；

參考ELISA#加樣  
溫 育：  
不好的操作原因：  
溫育時未貼封片或加蓋，使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗徹底；  
溫育時間人為延長，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗徹底。  
解決辦法：  
貼封片或加蓋：為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜復(fù)蓋板孔，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。  
按說明步驟嚴(yán)格控制操作時間。  
建議采用空氣浴進(jìn)行溫育。  
參考ELISA實(shí)驗操作中的溫育（incubation）  
洗 板：  
結(jié)果不好的可能原因  
采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉。  
采用半自動洗板機(jī)洗板時，洗液量不足，導(dǎo)致洗板不徹底；洗板針堵塞，抽吸不完全；洗板不暢，導(dǎo)致洗板效果差。  
反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長。  
在間接法中如本底較高。 

在ELISA 操作中，洗滌是*主要的關(guān)鍵技術(shù)，操作時尤為注意：  
保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板後在吸水紙或毛巾（選擇干凈、無或少塵的吸水材料）上輕輕拍干（若使用易掉渣的紙，紙屑會留在板孔中，由于紙屑中含有氧化劑而造成高值陰性。）；  
注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應(yīng)按要求稀釋，所用的水電導(dǎo)率在1.5us/cm 之下，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解後配制。  
保證洗板浸泡時間為40 秒左右，孔內(nèi)液體被洗板機(jī)吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。  
合理安排，或多用幾臺洗板機(jī)。  
在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。  
參考ELISA#洗滌  
顯 色：  
結(jié)果不好的可能原因  
顯色劑配制後放置時間過長或使用過期顯色劑；  
加顯色劑時濺出孔外造成液體回流。  
解決方法：  
顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用；  
加樣時保持顯色劑不外流，且加樣量要準(zhǔn)確，順序不能顛倒。  
A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。  
可以參考ELISA#顯色和比色  
終 止：  
結(jié)果不好的可能原因：  
加終止液時產(chǎn)生較多氣泡，導(dǎo)致假陽性增加。 

解決方法：  
加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，及時終止顯色。  
讀 板：  
結(jié)果不好的可能原因：  
讀板時板底底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面。  
應(yīng)保證酶標(biāo)板清潔。  
此外酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30 分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。  
全過程：  
整個操作過程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸;  
實(shí)現(xiàn)ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)自動化，有效提高檢測質(zhì)量。 

嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。在實(shí)際操作中必須嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖黠L(fēng)檢測每一份標(biāo)本，才能保證試驗效果。

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