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人多藥耐藥相關(guān)蛋白試劑盒操作原理

點(diǎn)擊次數(shù)：13476 發(fā)布時間：2011/12/22 11:02:31

　　　　　　　本試劑僅供研究使用

試驗原理：

MRP試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知MRP濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將MRP和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中MRP的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制：

試劑盒成份	96孔配置	48孔配置
96/48人份酶標(biāo)板	1塊板（96T）	半塊板（48T）
塑料膜板蓋	1塊	半塊
標(biāo)準(zhǔn)品：120ng/ml	1瓶（1.0ml）	1瓶（0.5ml）
空白對照	1瓶（1.0ml）	1瓶（0.5ml）
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液	1瓶（8.0ml）	1瓶（4.0ml）
生物素標(biāo)記的抗MRP抗體	1瓶（8.0ml）	1瓶（4.0ml）
親和鏈酶素-HRP	1瓶（12ml）	1瓶（5ml）
洗滌緩沖液	1瓶（20ml）	1瓶（10ml）
底物A	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）
底物B	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）
終止液	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）

自備材料：

1. 蒸餾水。

2. 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3. 振蕩器及磁力攪拌器等。

樣品收集、處理及保存方法：

1、血清……操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血紅

細(xì)胞迅速小心地分離。

2、血漿……EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、 細(xì)胞上清液……1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、 組織勻漿……將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液。

5、保存……如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

操作注意事項：

● 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

● 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

● 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

● 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

● 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

● 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。

● 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

● 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

安全性：

1. 避免直接接觸終止液和底物A、B，一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

2. 實難中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

試劑的準(zhǔn)備：

1. 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備，不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行：

120 ng/ml	（6號標(biāo)準(zhǔn)品）	原倍濃度不用稀釋直接加入50ul
60 ng/ml	（5號標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
30 ng/ml	（4號標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
15 ng/ml	（3號標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
7.5 ng/ml	（2號標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
3.75 ng/ml	（1號標(biāo)準(zhǔn)品）	100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0 ng/ml	（空白對照）	原倍濃度不用稀釋直接加入50ul

2. 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

試劑盒性能：

1. 靈敏度：*小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。

3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

操作步驟：

1. 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。

3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。

4. 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

5. 每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6. 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

7. 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。

8. 取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié) 果判斷與分析：

1、 儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

2、 以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的MRP標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的MRP含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

3、 檢測值范圍： 0-120ng/ml

4、 敏感度：0.1ng/ml

原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司