恒遠(yuǎn)分享elisa試劑盒具體操作步驟

1 elisa試劑盒詳細(xì)操作步驟
2 試劑的準(zhǔn)備
按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。
3 加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。
4 保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后�？乖�抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當(dāng)。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有*貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達頂峰。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度�？乖�抗體反應(yīng)4℃更為徹底，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜，以形成*多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，*后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。
5 洗滌
洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來�？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是*主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種，過程如下：
（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復(fù)操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
（2）流水沖洗式 流水沖洗法*初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續(xù)沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。
6 顯色和比色
（1） 顯色
顯色是ELISA中的*后一步溫育反應(yīng)，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴(yán)格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間，及時判斷。
OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再延長反應(yīng)時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進行，顯色反應(yīng)結(jié)束時加入終止液終止反應(yīng)。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。 TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。
（2） 比色
比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96孔的座架中，才可進行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。比色時應(yīng)先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。比色結(jié)果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。
（3） 酶標(biāo)比色儀
酶標(biāo)比色儀簡稱7 結(jié)果判斷
定性測定
定性測定的結(jié)果判斷是對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出"有"或"無"的簡單回答，分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標(biāo)本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng)。"陰性"則為無反應(yīng)。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來表示反應(yīng)的強度，其實質(zhì)仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應(yīng)的稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。 在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。
（1） 間接法和夾心法
這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標(biāo)本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在ELSIA中，正常人血清反應(yīng)后�？沙霈F(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物（見3.6）。在用肉眼判斷結(jié)果時，更宜用顯色深于陰性對照作為標(biāo)本陽性的指標(biāo)。目視法簡捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應(yīng)該用比色計測定吸光值，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標(biāo)本（sample，S）、陽性對照（P）、和陰性對照（N）的吸光值，然后進行計算。計算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標(biāo)本與陰性對照比值法兩類。
a． 陽性判定值
陽性判定值（cut-off value）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。用此法判斷結(jié)果要求實驗條件十分恒定，試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化，陽性和陰性的對照品應(yīng)符合一定的規(guī)格，須配用精密的儀器，并嚴(yán)格按規(guī)定操作。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標(biāo)本的實驗檢測而得到的�，F(xiàn)舉某種檢測HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿，陽性對照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng/ml。每次試驗設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后，先計算陰性對照A值的平均數(shù)（NCX）和陽性對照A值的平均數(shù)（PCX），兩個平均數(shù)的差（P-N）必須大于一個特定的數(shù)值（例0.400），試驗才有效。3個陰性對照A值均應(yīng)≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中超出此范圍，則棄去，而已另兩個陰性對照重新計算NCX；如有兩個陰性對照A值超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算：
陽性判定值=NCX+0.05 標(biāo)本A值＞陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為陰性。應(yīng)注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數(shù)，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。
根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會產(chǎn)生"試驗無效"的后果。
b.標(biāo)本/陰性對照比值
在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（S）和陰性對照（N）的A值后，計算S/N值。也有寫作P/N的，這里的P不代表陽性（positive），而是病人（patient）的縮寫，不應(yīng)誤解。為避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽性標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)多為各種測定所沿用。實際上每一測定系統(tǒng)應(yīng)該用實驗求出各自的S/N的閾值。更應(yīng)注意的是，N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清。有的試劑盒中所設(shè)陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類試
b. 抑制率法
抑制率表示標(biāo)本在競爭結(jié)合中標(biāo)本對陰性反應(yīng)顯色的抑制程度，按下式計算：抑制率（%）= （陰性對照A值-標(biāo)本A值）×100%/陰性對照A值.一般規(guī)定抑制率≥50%為陽性，＜50%為陰性。
定量測定
ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數(shù)紙，以檢測物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是*理想的檢測區(qū)域。
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