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elisa實驗最新過程分析

點擊次數(shù):13175   發(fā)布時間:2013/4/15 10:27:47

實驗原理

 

ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行,每加入一種試劑孵育后,可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中,通過不同的設(shè)計,具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法(圖a)、用于檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

 

實驗試劑

 

1. 試劑

  1) 包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液):

      Na?CO3    1.59克

      NaHCO3  2.93克

      加蒸餾水至1000ml

  2) 洗滌緩沖液(PH7.4 PBS):0.15M

      KH2 PO4      0.2克

      Na2 HPO ·12H2 O  2.9克

      NaCl       8.0克

      KCl        0.2克

      Tween-20 0.05% 0.5ml

      加蒸餾水至1000ml

  3) 稀釋液:

       牛血清白蛋白(BSA) 0.1克

       加洗滌緩沖液至100ml

    或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5~10%使用。

  4) 終止液(2M H2SO4):

    蒸餾水178.3ml,逐滴加入濃硫酸(98%)21.7ml。

  5) 底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):

    0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml

    0.1M 檸檬酸(19.2克/L)      24.3ml

    加蒸餾水50ml。

  6) TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液:

    TMB(10mg/5ml無水乙醇) 0.5ml

    底物緩沖液(PH5.5)    10ml

    0.75%H2O2    32μl

  7) ABTS使用液:

    ABTS        0.5mg

    底物緩沖液(PH5.5)  1ml

    3%H2O2   2μl

  8) 抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。

  9) 正常人血清和陽性對照血清。

實驗設(shè)備

ELISA試劑盒,人ELISA試劑盒,大鼠ELISA試劑盒,小鼠ELISA試劑盒,裸鼠ELISA試劑盒,倉鼠ELISA試劑盒

聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標(biāo)板)40孔或96孔,ELISA檢測儀,50μl及100μl加樣器,塑料滴頭,小毛巾,洗滌瓶。

小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

4℃冰箱,37℃孵育箱。

實驗步驟

 

方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:

1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,4℃過夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡稱洗滌,下同)。

2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。

3. 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小時,洗滌。

4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分鐘。

5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越強,陰性反應(yīng)為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“ ”、“-”號表示。也可測O·D值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值,若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。

方法二 用于檢測未知抗體的間接法:

      用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,
      每孔加0.1ml,4℃過夜。次日洗滌3次。

              ↓

      加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔
      中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)

              ↓

      于反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml,
      37℃孵育30-60分鐘,洗滌,*后一遍用DDW洗滌。

              ↓

      其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

注意事項

 

1. 正式試驗時,應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高,說明有非特異性反應(yīng),可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

2. 在ELISA中,進(jìn)行各項實驗條件的選擇是很重要的,其中包括:

  1) 固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進(jìn)行篩選:用等量抗原包被,在同一實驗條件下進(jìn)行反應(yīng),觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

  2) 包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時,要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度,時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18~24小時。蛋白質(zhì)包被的*適濃度需進(jìn)行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進(jìn)行包被后,在其它試驗條件相同時,觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值而蛋白量*少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1~10μg/ml。

  3) 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

  4) 酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng),而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用,應(yīng)注意防護。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后,應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是H2 O2 在臨用前加入。

原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司

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